液相色譜法測(cè)定胃腸舒顆粒中黃芪甲苷的含量

胃腸舒顆粒由黃芪、白芍、白花蛇舌草、延胡索（醋制）、甘草等組成，具有益氣養(yǎng)陰、活血止痛、清熱解毒之功效，臨床上用于治療萎縮性胃炎等各種消化道慢性炎癥。處方中黃芪為君藥，而黃芪甲苷則為黃芪的主要活性成分之一。由于黃芪甲苷的含量測(cè)定可作為胃腸舒顆粒質(zhì)量控制指標(biāo)之一，為有效控制胃腸舒顆粒的質(zhì)量，筆者在參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上采用靈敏度高、專(zhuān)屬性強(qiáng)的液相色譜法（HPLC）測(cè)定胃腸舒顆粒中黃芪甲苷的含量。
1 儀器與試藥液相色譜儀，包括P5000輸液泵、UV5000檢測(cè)器（上海禾工科學(xué)儀器）；N2000工作站（浙大智達(dá)信息工程有限公司）；TG332A型微量分析天平（上海天平儀器廠，分度值：0.01mg）。黃芪甲苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：0781—200109）；胃腸舒顆粒（第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院藥劑科自制，批號(hào)：20020724、20021127、20030313）；乙腈、甲醇為色譜純；正丁醇、石油醚為分析純。
2 方法與結(jié)果
2．1 色譜條件色譜柱：Irregular C18（250mm×4.6mm，10μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（30：70）；柱溫：室溫；流速：1.2ml／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：203nm；進(jìn)樣量：20μ1。
2．2 對(duì)照品溶液的制備準(zhǔn)確稱(chēng)取黃芪甲苷對(duì)照品4.809mg，置于10ml容量瓶中，加甲醇適量溶解并稀釋至刻度，即得。
2．3 供試品溶液的制備準(zhǔn)確稱(chēng)取胃腸舒顆粒約15g，置于錐形瓶中，加入甲醇50ml，超聲處理30min，濾過(guò)，棄去初濾液。準(zhǔn)確量取續(xù)濾液25ml，水浴蒸干，殘?jiān)铀?0ml溶解，并用石油醚萃取4次，每次10ml，棄去石油醚層，水層揮發(fā)至無(wú)醚味。繼續(xù)用飽和正丁醇萃取5次，前2次為15ml，后3次為10ml，合并正丁醇提取液，用1％的氫氧化鈉溶液洗滌3次，每次15ml，棄去氫氧化鈉溶液。將正丁醇溶液蒸干，殘?jiān)尤?ml甲醇溶解， 并用0.45μm 微孔濾膜濾過(guò)，即得。
2．4 陰性對(duì)照品溶液的制備按處方配制不含黃芪的樣品顆粒，并按“2．3”項(xiàng)下方法對(duì)樣品進(jìn)行處理，即得。
2．5 色譜行為與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)分別精密吸取“2．2”、“2．3”和“2．4”項(xiàng)下溶液各20μ1，按“2．1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄HPLC色譜。其中，理論塔板數(shù)按黃芪甲苷峰計(jì)算不低于3100。
2．6 線(xiàn)性關(guān)系考察精密吸取“2．2”項(xiàng)下溶液適量，分別配制成濃度為0.240、0.120、0.060、0.030、0.015mg／ml的溶液，并按“2．1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣20μ1，記錄基線(xiàn)構(gòu)成之面積稱(chēng)峰面積。A＝×σ×h＝2.507σh＝1.064 Wh/2h>峰面積（A）。以A為縱坐標(biāo)，濃度（C）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程為A=1.319×0.000001C一3.468×0.001（r=0.9998），表明黃芪甲苷濃度在0.015～0.240mg／ml范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。
2．7 樣品含量測(cè)定取3批樣品，按“2．3”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，各取20μ1，按“2．1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，并以外標(biāo)法計(jì)算樣品中黃芪甲苷的含量。
2．8 加樣回收率試驗(yàn)準(zhǔn)確稱(chēng)取已知黃芪甲苷含量的3批胃腸舒顆粒各約15g，準(zhǔn)確加入黃芪甲苷對(duì)照品溶液適量，并按“2．7”項(xiàng)下方法測(cè)定含量，計(jì)算回收率。
2．9 精密度試驗(yàn)精密吸取“2．2”項(xiàng)下溶液，按“2．1．項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)得黃芪甲苷峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為0.87％，表明其精密度良好。
2．10 穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取“2．2”項(xiàng)下溶液，按“2．1．．項(xiàng)下色譜條件在0、4、8、12、24h分別進(jìn)樣20>1并測(cè)定峰面積，結(jié)果黃氏甲苷峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為1.45％（n=5），表明本品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。
2．1l 重現(xiàn)性試驗(yàn)取同一批胃腸舒顆粒5份，按“2．7”項(xiàng)下方法分別進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為2.3％，表明本法重現(xiàn)性較好。
3 討論筆者參考相關(guān)文獻(xiàn) ，在制備供試品溶液過(guò)程中曾采用氨試液洗滌正丁醇，結(jié)果樣品色譜圖中黃芪甲苷干擾峰較多。而改用1％氫氧化鈉溶液洗滌后則效果滿(mǎn)意，因胃腸舒顆粒中的化學(xué)成分較多，以正丁醇萃取后用1％的氫氧化鈉溶液可除去甘草等中藥中的酸性成分，減少干擾。筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)，以甲醇-水（50：50）、甲醇-水（30：70）、乙腈（國(guó)產(chǎn)）-水（30：70）為流動(dòng)相時(shí)黃芪甲苷峰均出現(xiàn)倒峰而且干擾峰較多，而改用進(jìn)口乙腈后上述現(xiàn)象有很大的改善且干擾明顯降低。因此，流動(dòng)相的質(zhì)量好壞對(duì)峰形和出峰時(shí)間都有一定影響。