液相色譜法測(cè)定飼料中黃曲霉素B1

丁　平　侯亞莉　程曉偉　重慶市飼料獸藥監(jiān)察所

　　黃曲霉素是黃曲霉與寄生霉素產(chǎn)生毒株的代謝產(chǎn)物,它是化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的一類(lèi)化合物,根據(jù)其結(jié)構(gòu)的差異分別被稱(chēng)為黃曲霉素B1 、B2 、G1 和G2 等,其中以黃曲霉素B1 zui為常見(jiàn),也是已知zui強(qiáng)的化學(xué)致癌物之一,對(duì)糧油食品的污染較為嚴(yán)重。飼料檢測(cè)
中常以黃曲霉素B1 為指標(biāo),我國(guó)的飼料*通常為10～50μg/ kg。國(guó)內(nèi)外有關(guān)黃曲霉素B1 的檢測(cè)方法主要有:薄層色譜法、酶聯(lián)免疫測(cè)定法、液相色譜法和熒光光度法。試驗(yàn)采用了免疫親和柱對(duì)飼料中黃曲霉素B1 進(jìn)行凈化,對(duì)液相色譜熒光檢測(cè)方法進(jìn)行了研究,為監(jiān)控飼料中黃曲霉素B1 提供了簡(jiǎn)便可行的方法。
1 　材料與方法
1. 1 　儀器和試劑
儀器　Angilent 1100 液相色譜儀,2475 多波長(zhǎng)熒光檢測(cè)器,METTLER AE 240 電子天平,振蕩器,渦旋混合儀,微孔慮膜（0. 45μm） ,玻纖濾紙,免疫親和色譜柱（北京安易世紀(jì)貿(mào)易有限公司提供） 。
試劑　黃曲霉素B1 標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mg/ L） ,由Sig2ma 公司提供,三氟乙酸,甲醇（色譜純） ,水為超純水。

1. 2 　溶液的配制
1. 2. 1 　樣品提取液取550 mL 甲醇,用水定容至1 000 mL ,混勻。
1. 2. 2 　流動(dòng)相取450 mL 甲醇,用水定容至1 000 mL ,混勻。
1. 2. 3 　黃曲霉素B1 衍生標(biāo)樣的配制分別準(zhǔn)確吸取一定量的標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)備液,置于5 mL玻璃試管中,在50 ℃水浴鍋N2 流下吹干,加300μL的衍生化試劑三氟乙酸進(jìn)行衍生,在室溫下放置3 min。在50 ℃水浴鍋N2 流下吹干,用1 mL 甲醇、乙腈和水等體積混合的溶液溶解,配置成濃度為1、
2、5、10 和20 μg/ L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別進(jìn)行HPLC 檢測(cè)。
1. 3 　樣品的處理
準(zhǔn)確稱(chēng)取樣品5. 0 g ,置于150 mL 具塞錐形瓶中,加入1. 0 g 氯化鈉和40. 0 mL 樣品提取液,往復(fù)振蕩30 min ,用玻纖濾紙過(guò)濾。準(zhǔn)確移取10. 0 mL濾液并加入30. 0 mL 水稀釋,注入已用水平衡至室溫的IAC 小柱,用3 mL 水淋洗,用3 mL 甲醇洗脫,收集洗液置玻璃試管中,在50 ℃水浴鍋N2 流下吹干。按標(biāo)準(zhǔn)品衍生方法處理后進(jìn)行HPLC 檢測(cè)。
1. 4 　回收率的測(cè)定
稱(chēng)取空白飼料5. 0 g ,置于150 mL 具塞錐形瓶中,分別加入標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,使樣品中藥物濃度分別為20. 0 、10. 0 和2. 0μg/ kg ,混勻后靜置10 min ,每個(gè)濃度水平設(shè)4 個(gè)平行,按1. 3 的方法分別處理和測(cè)定。
1. 5 　色譜條件
色譜柱　C18 柱,250 mm ×4. 6 mm ,粒徑5μm;柱溫25 ℃;流動(dòng)相450 mL 甲醇+ 550 mL 水;激發(fā)波長(zhǎng)365 nm;發(fā)射波長(zhǎng)435 nm;進(jìn)樣量25μL 。
2 　結(jié)果與分析
2. 1 　測(cè)定方法的線(xiàn)性響應(yīng)
取配置好的標(biāo)準(zhǔn)溶液在選定的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定, 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（ 見(jiàn)圖1） 。在濃度為1 ～50μg/ L時(shí)拖尾峰（tailing peak）。前者少見(jiàn)。>色譜峰面積與濃度呈線(xiàn)性相關(guān),其回歸方程為y = 2. 524 1 x + 0. 272 2 ,相關(guān)系數(shù)r2 = 0. 999 8。其線(xiàn)性響應(yīng)范圍*測(cè)定的要求,表明該方法定量測(cè)定可靠。

2. 2 　測(cè)定方法的靈敏度
在試驗(yàn)條件下,按信噪比（S/ N） 為3 計(jì)算,求得飼料中黃曲霉素B1 的檢測(cè)限為0. 01μg/ kg ,按S/ N為10 計(jì)算,求得飼料中黃曲霉素B1 的定量限為0. 03μg/ kg ,滿(mǎn)足定量分析的要求。
2. 3 　添加回收率試驗(yàn)
添加回收率及結(jié)果的變異系數(shù)見(jiàn)表1。標(biāo)準(zhǔn)品、空白飼料樣品及添加標(biāo)準(zhǔn)品的飼料樣品的色譜圖見(jiàn)圖2 ,本方法條件下黃曲霉素B1 的保留時(shí)間約為8. 3 min。
從表1 可以看出,在3 個(gè)飼料添加水平下,黃曲霉素B1 的平均回收率為74. 9 %～81. 6 % ,變異系數(shù)為0. 01 %～0. 04 %。

3 　討論
       本方法采用甲醇- 水提取飼料樣品,通過(guò)IAC柱凈化濃縮,以HPLC 熒光檢測(cè)法測(cè)定黃曲霉素B1的含量。從空白飼料樣品的色譜圖和添加飼料樣品的色譜圖可以看出,黃曲霉素B1 色譜峰附近沒(méi)有雜質(zhì)峰,說(shuō)明飼料中的雜質(zhì)對(duì)本測(cè)定方法沒(méi)有干擾。
從表1 看出, HPLC 法有較高的回收率（ 平均77. 5 %） 和良好的重現(xiàn)性（平均變異系數(shù)0. 03 %） 。由于黃曲霉素的毒性很大,現(xiàn)在對(duì)黃曲霉素的*達(dá)到2～4μg/ kg 以下甚至更低。對(duì)黃曲霉素含量的*越低,表明對(duì)檢測(cè)儀器和方法的要求越高。復(fù)雜的操作、大量的有機(jī)試劑、嚴(yán)格的防護(hù)條件及對(duì)操作者的損害等都不適合形勢(shì)發(fā)展的要求。試驗(yàn)用免疫親和色譜- HPLC 法代替了常用的薄層法,減少了操作步驟和有機(jī)溶劑的損耗。國(guó)標(biāo)食品中黃曲霉素的測(cè)定采用柱后衍生化HPLC - 熒光光度法,試驗(yàn)采用了這一方法,對(duì)儀器的要求降低了。
        試驗(yàn)研究了進(jìn)樣體積對(duì)黃曲霉素B1 峰型的影響,當(dāng)進(jìn)樣量為100μL 時(shí),樣品峰的峰型很不對(duì)稱(chēng),有前延峰。后改用50μL 的進(jìn)樣量時(shí),峰型得到很大的改變,也很對(duì)稱(chēng)。由于25μL 進(jìn)樣時(shí)也能滿(mǎn)足定量的要求,試驗(yàn)zui后確定進(jìn)樣量為25μL 。在樣品提取時(shí),振蕩的時(shí)間應(yīng)足夠,剛開(kāi)始試驗(yàn)時(shí),提取時(shí)間是15 min ,回收率很低,不能滿(mǎn)足定量的要求。當(dāng)振蕩時(shí)間延長(zhǎng)為30 min 時(shí),回收率得到較大的提高,能滿(mǎn)足飼料檢測(cè)的要求。
試驗(yàn)結(jié)果表明,免疫親和色譜—HPLC 法操作簡(jiǎn)便易行,能滿(mǎn)足分析的要求,是測(cè)定飼料中黃曲霉素B1 的一種靈敏且可靠的方法。

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